蛋白质分离纯化步骤（二） 分离纯化蛋白质的一般程序 2.1 材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1，智能蛋白纯化系统***的选择. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破，智能蛋白纯化系统***的选择。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4，智能蛋白纯化系统***的选择. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。智能蛋白纯化系统***的选择

    蛋白质纯化方法-亲和层析亲和层析法包括特异性配体亲和层析法以及通用性配体亲和层析法。比较这两种亲和层析法。特异性配体亲和层析法通常将复杂的生命大分子物质作为配体，它的结合力比较大河吸附选择性比较强。而通用性配体亲和层析法通常将简单的小分子物质作为配体，因此，它具有低廉的成本，吸附容量比较高，通过对吸附和脱附条件的改善能够使得层析的分辨率提高。原理亲和层析的原理类似于酶-底物，***-受体与抗原-抗体等特异性反应的机理。有一定的亲和力在每对反应物之间。与在酶与底物的反应中，只有特异的底物才可以结合一定的酶，使复合物产生相同。在亲和层析中，只有特异的配体才可以和一定的生命大分子有亲和力，并且使复合物产生。亲和层析配体呈固相，而酶与底物的反应底物呈液相是它们的不同点。事实上，亲和层析是在含有活化基团的基质M上以共价键的方式固化具有识别能力的配体L，将固相载体制作成功而固化后的配体束缚特异物质的能力依然保持。所以当在小层析柱装入固相载体，使得欲分离的样品在该柱经过。此时，样品中对配体有亲和力的物质S就能够通过结构互补效应、范德瓦尔力与静电引力等作用在固相载体上吸附着。 样品前处理化学分析蛋白纯化系统

蛋白质分离纯化步骤（二） 2.2 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 2.3蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、**，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作.

三、蛋白质分子量的测定 蛋白质分子量测定的方法很多，目前常用的方法有以下几种。 3.1 凝胶过滤法 凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理如“分离纯化方法”中所 述。一定型号的凝胶颗粒上具有一定大小的孔隙，只允许较小的分子进入胶粒，而大于孔隙的分子则不能进入胶粒而被排阻在胶粒外面。用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱下来，随后能够进入颗粒的蛋白质也按分子量大小而先后被洗脱下来，分子量越小的越后被洗脱下来。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准进行层析分析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行层析分析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量来。

蛋白质分离纯化步骤（二） 2.4.2 纤维素柱层析法 该法是利用蛋白质的酸碱性质作为分离的基础。离子交换纤维素（cellulose ion-exchanger）是人工合成的纤维素衍生物，它具有松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，使蛋白质大分子可以自由通过。因此常用于蛋白质的分离。 （1）羧甲基纤维素（CM-纤维素） 在纤维素颗粒上带有羧甲基基团。在中性pH条件下，羧甲基上的质子可解离下来（图2-27a），而溶液中带正电荷的蛋白质分子可与纤维素颗粒上的羧甲基负电荷结合。可交换的基团带正电，因此是一种阳离子交换剂。蛋白质与离子交换纤维素之间结合能力的大小取决于彼此间相反电荷基团之间静电吸引。 (2）二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素） 在中性pH条件下，它含有带正电荷的基团，可与溶液中的带负电荷的蛋白质结合，可交换的基团带负电荷，因此是一种阴离子交换剂。当某一蛋白质混合溶液通过装有DEAE-纤维素的层析柱时，带正电荷的蛋白质不能结合而随着洗脱液的流动先被洗脱下来。带负电荷的蛋白质将被结合到柱上。结合力取决于彼此相反电荷基团间的静电吸引。然后选用一定pH和离子强度的缓冲液进行洗脱，改变蛋白质分子所带的静电荷，依次从层析柱流出达到相互分离的目的。样品前处理智能蛋白纯化系统厂家报价

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蛋白质分离纯化步骤 蛋白质分离纯化的一般原则： 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一**成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。智能蛋白纯化系统***的选择

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