⑹、滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10-30分钟。⑺、PBS冲洗，5分钟x3次，江苏六色免疫组化检测服务。⑻、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10-30分钟。⑼、PBS冲洗，5分钟x3次。⑽、显色剂显色3-15分钟（DAB或NBT/BCIP）⑾、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。免疫组化化染色步骤冰冻切片4-8μm，室温放置30分钟后，入4℃**固定10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。免疫组化判定分析编辑免疫组化染色（IHC）从实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析，图片的确定与选取，相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容，只有严格的实验设计，标准的实验操作，专业化的结果分析才能更好的满足客户的要求，这点对于形式为腹水，上清，培养液之类的抗体显得更为重要。关于上述服务内容应该在实验开始前由双方明确，一般而言，客户方实验前应提出需要什么样的结果与分析，例如是简要还是详细的描述实验结果，江苏六色免疫组化检测服务，江苏六色免疫组化检测服务，需要实验数据否，图片的数量与规格等。如果为双盲试验或有第三方参与，则事先申明。免疫组化意义编辑近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现。江苏六色免疫组化检测服务

    形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，***用底物显色剂显色。酶标抗体间接法的操作步骤·标本准备：–石蜡脱蜡至水；–冰冻切片浸入4C**固定10min，PBST漂洗，5min×3；–细胞爬片先用PBS洗，然后4C**固定10min，再PBST漂洗，5min×3；·石蜡切片需要进行抗原修复，其它标本则不用；(2)酶标抗体间接法的操作步骤(续)·封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2-甲醇溶液室温孵育5～10min(湿盒内)；·PBST漂洗，5min×3；·5～10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育30min(湿盒内)；·倾去血清勿洗，加1%BSA(PBST配制)稀释的一抗，37C孵育60min或4C过夜(湿盒内)；(2)酶标抗体间接法的操作步骤(续)·PBST漂洗，5min×3；·加HRP标记的二抗室温孵育lh或37C30min；·加(显色液应新鲜配置)；·经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。(2)非标记抗体酶法——酶桥法·首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；·以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上；·再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布–优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。北京多色荧光免疫组化

    问题及其解答：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？1、抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是**重要的一条。2、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3、内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4、非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5、DAB孵育时间过长或浓度过高；6、PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要；7、标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。我的实际解决方案：以上的分析可能对于初学者还是不容易的，下面我就把我的排除实验的具体过程与大家进行分享、交流和讨论。1、首先排除抗体孵育条件。一般来说，着色效果的好坏与抗体的孵育条件是密不可分的，由于用SP法已经做出来过一次且效果不错，因此对于同样组织的同一抗原进行分析，这种因素可以先排除。2、其次，DAB孵育时间是否太长？做出来那一次我是孵育8min，后来也是8-10min。

    续)·**过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血·血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；·加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。免疫细胞化学技术标本的制备·标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件·免疫组化对组织和细胞标本的要求–保持所检标本原有的结构、形态；–在原位很大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。·免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。–各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的比较好方法。免疫组化中常用的组织和细胞标本·组织标本–石蜡切片–冰冻切片·细胞标本–组织印片–细胞培养片(细胞爬片)–细胞涂片免疫细胞化学技术石蜡切片·石蜡切片是制作组织标本**常用、**基本的方法–比较大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；–石蜡块还能长期存档，供回顾研究。·石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善。

    此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。4、几种常用免疫组化方法简单介绍1）免疫荧光方法是**早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。2）免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是**常用的技术。该方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。江苏六色免疫组化检测服务

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    是分泌性蛋白检测优先方法之一。下面介绍下免疫组化方法的具体实验流程步骤。实验流程简介一、SP三步法1）石蜡切片，常规脱蜡至水。2)（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次.5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（比较好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。8)PBS冲洗，3分钟×5次。9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟-1h。10)PBS冲洗，3分钟×5次。11）显色剂显色（DAB等）。12）自来水充分冲洗。13）可进行复染，脱水，透明。14）选择适当的封片剂封片。二、即用型二步法1）脱蜡、水化组织切片。2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。3)，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。4）滴加一抗，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。5）滴加enhangcer增强剂，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。江苏六色免疫组化检测服务

上海朝瑞生物科技有限公司于2003-01-22成立，注册资本700-1000万元元，现有专业技术人员5~10人人，各种专业人员齐备。致力于创造***的产品与服务，以诚信、敬业、进取为宗旨，以建zrbiorise,SPRICELL,scienceladde产品为目标，努力打造成为同行业中具有影响力的企业。公司以用心服务为重点价值,希望通过我们的专业水平和不懈努力,将1.发布科研技术 2.发布应用技术 3.发布专业专长 4.发布科研成果 5.发布我的需求 6.发布筛选检验检测服务 7.发布协同代研发服务 8.发布升级改造产品服务 9.发布实验室及仪器设备共享 10.发布培训基地共享 11.发布工厂代加工及共享车间 12.发布科研/项目团队招聘13.发布研究生婚恋 14.发布项目整包服务 15.发布资源交换业务等业务进行到底。自公司成立以来，一直秉承“以质量求生存，以信誉求发展”的经营理念，始终坚持以客户的需求和满意为重点，为客户提供质量的[ "科研技术服务", "应用技术服务", "科研成果转化", "科学产品销售" ]，从而使公司不断发展壮大。

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