实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）技术是在PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术，它是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，然后利用荧光信号的积累强弱实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知的DNA模板进行定量，天津食品安全荧光定量PCR实验技术服务，实现了PCR从定性到定量的飞跃，为快速准确地分析样本中的各类待检物质提供了崭新的技术工具，现在已被广泛应用于实验室及临床**标志物的检测。Real-Time PCR与传统的PCR技术相比其使用了荧光探针标记特定核酸从而提高了准确性；灵敏度提高故使用较少的样本量，天津食品安全荧光定量PCR实验技术服务，从而减少了样本消耗殆尽的风险，天津食品安全荧光定量PCR实验技术服务，在一小时左右即可出结果，简化了传统PCR方法；全封闭管分析、利用电脑分析软件对PCR扩增产物的实时动态的检测和自动定量，定量动态范围高达五个数量级，且结果重现性较好，这也提高了检测的灵敏度和精密度。 天津食品安全荧光定量PCR实验技术服务

转基因：利用荧光定量PCR技术将转基因信号扩增放大。

在环境监测方面的应用实时荧光定量PCR技术已经被国内外应用在环境监测中，提高了监测水平。此项技术可以检测河流中环境微生物随着季节变化的情况。还可以用来对地表水和饮用水中致病菌进行检测以便及时预告地表水污染情况以及采取相应有效措施避免大范围污染

仪器摆放：实时荧光定量 PCR 仪应安放在湿度较低、灰尘较少、远离水池的平稳台面上，不能有强光直射，室内应通风良好，无腐蚀性气体 天津食品安全荧光定量PCR实验技术服务

为了正确地评估 PCR 效率，至少需要 3 次重复和至少 5 个数量级倍数的模板浓度。图 6 说了建议此精确级别的理由，它证明在 1 个数量级倍数与 5 个数量级倍数范围内测试稀释模板时，获得的斜率或效率可能产生数学偏差。因此，即使检测 ** 有效，由于每个稀释点都存在标准差，检测一个数量级倍数的连续稀释时，可能获得 70 至 170% 的范围。在 5 个数量级倍数范围内做相同数量的稀释点或重复，可能的偏移只有 ±8%。这意味着在 5 个数量级倍数范围内，如果效率为 94%，则该实验的效率范围介于 88% 到 ** 之间。为了准确测定 PCR 反应的效率，必须进行 5 个数量级倍数的连续稀释。-3.3 ±10% 的斜率意味着效率达到 ** ±±10%。PCR 反应效率越低，那么灵敏度越低。

实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高和精确性高的优点，此项技术已被应用于分子生物学、医学、食品检测和环境监测等多个领域 。在分子生物学领域的研究应用  定量核酸浓度：传统方法是用琼脂糖凝胶电泳或者分光光度计测定核酸浓度，其结果不准确而且易污染，实时荧光定量PCR可以解决这些问题，它的准确性、灵敏度高且无污染，对一些传染性疾病进行定量分析、病原微生物和***含量检测，此项技术都是优先

研究基因表达：应用实时定量PCR技术可以对基因时间、空间表达水平差异进行比较。例如，对特定基因用物理、化学、***等不同方法处理后的差异进行比较，为人们的科学研究提供依据

无论 Ct ***值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为 1 的系统都达到了灵敏度的极限。

如前文所述，效率是决定反应灵敏度的关键因素（图 5）。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，不能预期模板为正态分布。相反，它会遵循泊松分布，该分布预测在平均包含一个拷贝的起始模板的大量重复中，实际上约 37% 不含拷贝，*有约 37% 含有 1 个拷贝，18% 应包含 2 个拷贝（见图 9）。因此，为了可靠地检测低拷贝，必须做大量的重复实验来提供统计***性，以克服泊松分布的限制。 天津食品安全荧光定量PCR实验技术服务

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荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。同时，其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。

常用的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、***作用等进行改进，也推出了很多新的染料供大家选择。

Promega采用新型荧光染料BRYT Green® Dye，对qPCR反应没有***作用，与双链DNA结合后荧光信号更强. 天津食品安全荧光定量PCR实验技术服务

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