本发明属于生物检测技术领域：中的兽医动物病原检测，具体涉及一种用于犬腺bingduii型、犬瘟热bingdu、犬细小bingdu和犬副流感bingdu的四重实时荧光定量pcr检测方法、检测试剂盒及其**引物和taqman探针，武汉中**细小病菌质量推荐。背景技术：：犬瘟热bingdu(caninedistempervirus，cdv)、犬细小bingdu(canineprvovirus，cpv)、犬副流感bingdu(canineparainfluenzavirus，武汉中**细小病菌质量推荐，cpiv)和犬腺bingduii型(canineadenovirusii，cav-ii)是犬bingdu性传染病暴发和流行的主要病原体。cdv染上引起的犬瘟热主要有呼吸型、消化型、神经型和混合型4种，cdv染上可引起全身性的免疫压制，病死率极高，武汉中**细小病菌质量推荐。cpv主要引起犬的急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎。cpiv染上主要引起犬的呼吸道疾病，是犬传染性呼吸系统疾病重要的病原之一。cav-ii型引起与呼吸道疾病和肠炎相关的犬接触性呼吸道疾病，但不引起肺炎症状，可引起幼犬咳嗽又叫犬窝咳。这四种bingdu单一染上或混合染上均可给养犬业带来严重的打击，四种犬病原临床症状较为相似，且常伴有混合染上，给临床诊断造成了一定的困难。文献cna建立了用于同时检测犬瘟热bingdu、犬细小bingdu、i型和ii型犬腺bingdu的多重pcr检测引物。江岸宠物医院哪家好？武汉中**细小病菌质量推荐

    而拷贝数低或无拷贝数的样品bingdu含量不足，不能进行成品苗的配制，且s1-s3为cav2型bingdu疫苗半成品，s4-s6为cdvbingdu疫苗半成品，s7-s8为cpvbingdu疫苗半成品，s9-s10为cpivbingdu疫苗半成品，s11-s12为四种bingdu疫苗半成品。经检测s1-s3cav2型bingdu疫苗半成品可用于配苗，s4、s6cdvbingdu疫苗半成品可用于配苗，而s5拷贝数不达标不可用于配苗，s7cpvbingdu疫苗半成品可用于配苗，而s8拷贝数不达标不可用于配苗，s9-s10cpivbingdu疫苗半成品可用于配苗，s11-s12四种bingdu疫苗半成品可用于配制四联苗。实施例6、犬只源细胞检测使用实施例4的试剂盒对金宇保灵生物药品有限公司疫苗研究室提供的5份犬只源细胞的bingdu染上情况进行检测，检测方法与实施例2中步骤，待测样品编号为t1-t5，检测结果如下表6所示，可见本发明提供的对cav-ii、cpv、cdv和cpiv进行四重实时荧光定量pcr检测的试剂盒能够实现对犬只源细胞中bingdu染上的定性检测及bingdu含量的定量检测，可为疫苗生产过程中源材料的质量监控提供有力依据，确保疫苗生产的安全。表6：5份犬只源细胞样品的四重实时荧光定量pcr检测结果根据上表6的定性和定量检测结果。武汉中**细小病菌质量推荐武昌动物医院哪家好？

    并且本发明反应体系引入了vazyme的防污染试剂，可预防核酸气溶胶污染。、重复性检测按照实施例2中的方法，将分别携带cav-ii、cpv、cdv和cpivbingdu目的基因的4个标准品(cav2标准品、cpv标准品、cdv标准品和cpiv标准品)等浓度混合，按照10倍梯度稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μl，每个梯度重复三次，以不同浓度的标准品混合液作为模板，在实施例1中所示的引物和探针的引导下进行多重实时荧光定量pcr检测，pcr反应体系及反应条件参照实施例2。检测结果如图6和表4所示，从图6中可见每一个浓度梯度的扩增曲线较聚拢，循环数无明显差距，表明本发明针对cav-ii、cpv、cdv和cpiv的四重实时荧光定量pcr检测方法的重复性较好，循环数变异系数均小于3％。表4：cav-ii、cpv、cdv和cpiv实时荧光定量重复性试验结果实施例4、cav-ii、cpv、cdv和cpiv的四重实时荧光定量pcr检测试剂盒本实施例提供的cav-ii、cpv、cdv和cpiv的四重实时荧光定量pcr检测及鉴别试剂盒包括：实施例1中所示的用于对cav-ii、cpv、cdv和cpiv进行四重实时荧光定量pcr检测的引物(cav2-f/cav2-r、cdv-f/cdv-r、cpv-f/cpv-r和cpiv-f/cpiv-r)和taqman探针。

    研究表明h9亚型aiv容易与其他病原(bingdu和细菌等)混合染上，进而给我国养禽业造成更为严重的损失；其与其它不同亚型aiv混合染上时，毒株之间容易发生基因片段重组，并产生一些不可预知的新型禽流感bingdu，进而可能引起新型禽流感bingdu的大流行。2013年以来的部分报道还表明其可为h5n6和h7n9等高致病性亚型aiv的提供内部基因。由上述报道可见，h9亚型aiv与chpv都对家禽养殖业造成了严重的危害。鸡细小bingdu在正常鸡胚和细胞培养中难以大量增殖，因此应用bingdu分离及电镜观察等方法对该病进行诊断的难度很大。传统的禽流感bingdu检测方法是将bingdu分离培养后再进行血清学方法鉴定，培养周期长，且要用到较多标准阳性血清，但是禽流感bingdu不同亚型血清相互之间又存在不同程度的交叉免疫保护反应，其结果的准确性具有局限性，所以目前禽流感bingdu较多的采用分子生物学方法进行检测。分子生物学方法特别是rt-pcr检测技术具有快速、简便和准确等优点，在禽流感的诊断及大规模监测过程中应用广fan。由于aiv染上动物后具有相似的临床症状，混合染上的现象也普遍存在，所以在日常诊断中难以及时准确的对其进行鉴别确诊。近年来，随着分子生物学技术的发展。武汉狗狗宠物医院！！

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    末了通过标准曲线对未知模板进行定量分析(heidca，stevensj，livakkj，；6(10)：986-94.)。实时荧光定量pcr技术是一种对bingdu基因组进行检测的相对定量技术，与普通pcr技术相比，增加了一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确的优点，可以利用多种荧光基团实现多种基因的检测，并可利用中间的寡核苷酸探针实现相似性较高基因的鉴别。本发明基于以上基本原理针对四种bingdu设计了四对特异性引物和四条寡核苷酸探针，利用碱基互补配对的原理，建立了一种特异性检测cav-ii、cpv、cdv和cpiv的四重实时荧光定量pcr检测方法，并基于设计得到的特异性引物和探针提供一种能同时检测和鉴别cav-ii、cpv、cdv和cpiv的四重实时荧光定量pcr检测试剂盒。通过以下具体实施方式详细说明本发明。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《molecμlarcloning:alaboratorymanual》sambrook，j.，russell，davidw.，molecμlarcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(w/w，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(w/v。武汉中**细小病菌质量推荐

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