三、蛋白质分子量的测定 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子大小、所带电荷的量以及分子形状。而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同的是在样品及电泳缓冲液中加入了十二烷基***钠（sodium dodecylsulfate,SDS）。SDS是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS（一般加入量为0.1％）后，SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，这些电荷量远远超过蛋白质分子原来所带的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间的电荷差异。所有结合SDS的蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭园棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成正比。这样，消除了蛋白质之间原有的电荷和形状的差异，蛋白纯化系统制造厂家，电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小。 进行凝胶电泳时，常常用一种染料作前沿物质，蛋白纯化系统制造厂家，蛋白质分子在电泳中的移动距离和前沿物质移动的距离之比值称为相对迁移率，相对迁移率和分子质量的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲线，蛋白纯化系统制造厂家。将未知蛋白质在同样条件下电泳，根据测得的样品相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子量。蛋白纯化系统制造厂家

三、蛋白质分子量的测定 3.3 沉降法 沉降法又称超速离心法。蛋白质溶液在受到强大的离心力作用时，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质分子的大小、密度和分子形状有关，也与溶剂的密度和粘度有关。蛋白质颗粒在离心场中的沉降速度用每单位时间内颗粒下沉的距离来表示。 在离心场中，蛋白质分子所受到的净离心力（离心力减去浮力）与溶剂的摩擦力平衡时，每单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数（Sedimentation Coefficient）。国际上采用Svedberg单位作为沉降系数的单位，用S表示，以纪念超速离心法的创始人，瑞典***的蛋白质化学家T.Svedberg。一个Svedberg单位（或直接称一个S）为1×10—13s。蛋白质的沉降系数大约在1×10—13～200×10—13s范围内，即1S～200S。浙江样品前处理蛋白纯化系统

蛋白质分离纯化步骤（二） 2.4 样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。 1. 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析（gel-filtration chromatography）又称为分子排阻层析或分子筛层析。它是将葡聚糖凝胶（Sephadex）装入一个柱子中，制成凝胶柱。这种凝胶颗粒具有网状结构，不同类型凝胶的网孔大小不同。当把蛋白质混合样品加到凝胶柱中时，比凝胶网孔小的蛋白质可进入网孔内，而大于网孔的分子则不能进入被排阻在凝胶颗粒之外。当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质直接通过凝胶之间的缝隙先被洗脱下来，而比网孔小的蛋白质可连续不断地进入网孔内。这样的小分子不但流经的路程长，而且受到来自凝胶内部的阻力也很大，所以蛋白质越小，从柱子上洗脱下来所需时间越长。由于不同蛋白质的分子大小不同，进入网孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脱所用体积及时间不同，从而达到分离的目的。

蛋白质分离纯化步骤（二） 2.4.2 纤维素柱层析法 该法是利用蛋白质的酸碱性质作为分离的基础。离子交换纤维素（cellulose ion-exchanger）是人工合成的纤维素衍生物，它具有松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，使蛋白质大分子可以自由通过。因此常用于蛋白质的分离。 （1）羧甲基纤维素（CM-纤维素） 在纤维素颗粒上带有羧甲基基团。在中性pH条件下，羧甲基上的质子可解离下来（图2-27a），而溶液中带正电荷的蛋白质分子可与纤维素颗粒上的羧甲基负电荷结合。可交换的基团带正电，因此是一种阳离子交换剂。蛋白质与离子交换纤维素之间结合能力的大小取决于彼此间相反电荷基团之间静电吸引。 (2）二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素） 在中性pH条件下，它含有带正电荷的基团，可与溶液中的带负电荷的蛋白质结合，可交换的基团带负电荷，因此是一种阴离子交换剂。当某一蛋白质混合溶液通过装有DEAE-纤维素的层析柱时，带正电荷的蛋白质不能结合而随着洗脱液的流动先被洗脱下来。带负电荷的蛋白质将被结合到柱上。结合力取决于彼此相反电荷基团间的静电吸引。然后选用一定pH和离子强度的缓冲液进行洗脱，改变蛋白质分子所带的静电荷，依次从层析柱流出达到相互分离的目的。

蛋白质分离纯化步骤（二） 2.2 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 2.3蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、**，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作.样品前处理直销蛋白纯化系统上门安装

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