·若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。直接免疫荧光法的注意事项(续)·一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；·经荧光染色的标本比较好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。(2)间接法又称为荧光抗-抗体法需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，北京多色荧光免疫组化检测服务，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。–可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。间接免疫荧光法操作步骤·标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；·一抗染色：–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用)，37C作用30min或4C过夜。·PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；间接免疫荧光法操作步骤(续)·加荧光标记的二抗抗体，37C湿盒避光作用30min。·PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；·甘油缓冲液封片·镜检·优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，北京多色荧光免疫组化检测服务，北京多色荧光免疫组化检测服务，可应用于多种一抗；·缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。间接免疫荧光法的注意事项·荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h。北京多色荧光免疫组化检测服务

【多色免疫组化染色样本要求】1福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA都可以，封蜡不能有明显的破损。2玻片样本，组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。3组织**小应包含大于1000个细胞。4蜡块需包埋实体瘤组织，坏死瘤组织、细针穿刺物、细胞甩片样品会影响染色效果。5组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18～24小时。6切片厚度为4μm左右，使用防脱玻片。建议玻片在固定后一周内制备为佳。7不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，样本应置于玻片正面、**。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴，不要用纸擦拭玻片。8玻片置于45°C热盘上放置30min（自然风干玻片时长不小于1小时）。【设备耗材】1检验所需设备器材：荧光显微镜、通风橱、移液器、恒温干燥箱、微波炉、计时器2检测所需耗材器皿：免疫组化笔、微波修复杯、染色缸、孵育湿盒、盖玻片、洗瓶、量筒100ml、量筒1000ml等【试剂制备】1通用试剂：DMSO、miejun去离子水、二甲苯、乙醇（全部、95%、70%）、10%中性福尔马林、抗原修复液（推荐使用佰诺全景酸性或碱性抗原修复液）、一抗封闭液等。上海七色免疫组化

    免疫细胞化学技术抗原和抗体的要求·具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。–对抗体的要求：纯度高、比活性强；·高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。–对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。免疫细胞化学技术抗原(antigen,Ag)·抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：–免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；–免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。·根据抗原是否显示免疫原性分为：–完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。·免疫原性**强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。–半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和***等。·半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。载体·通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。–常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。

    这样你才能大胆地去**和纠正一些错误的步骤，如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是**重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。比如温度有4℃、室温、37℃。我推荐4℃比较好，反应**温和，背景较浅；而37℃反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。2、定位和定性是免疫组化比较大的优势。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定位较直接准确、定性灵敏度高，是定位检测分析优先方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析**为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。4、免疫组化实验一定要设置阳性和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。

    续)·**过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血·血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；·加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。免疫细胞化学技术标本的制备·标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件·免疫组化对组织和细胞标本的要求–保持所检标本原有的结构、形态；–在原位很大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。·免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。–各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的比较好方法。免疫组化中常用的组织和细胞标本·组织标本–石蜡切片–冰冻切片·细胞标本–组织印片–细胞培养片(细胞爬片)–细胞涂片免疫细胞化学技术石蜡切片·石蜡切片是制作组织标本**常用、**基本的方法–比较大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；–石蜡块还能长期存档，供回顾研究。·石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善。北京四色免疫组化

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上海朝瑞生物科技有限公司成立于2003-01-22，专业1.发布科研技术 2.发布应用技术 3.发布专业专长 4.发布科研成果 5.发布我的需求 6.发布筛选检验检测服务 7.发布协同代研发服务 8.发布升级改造产品服务 9.发布实验室及仪器设备共享 10.发布培训基地共享 11.发布工厂代加工及共享车间 12.发布科研/项目团队招聘13.发布研究生婚恋 14.发布项目整包服务 15.发布资源交换业务等多项业务，主营业务涵盖[ "科研技术服务", "应用技术服务", "科研成果转化", "科学产品销售" ]。公司目前拥有高技术人才5~10人人，以不断增强企业核心竞争力，加快企业技术创新，实现稳健生产经营。公司业务范围主要包括：[ "科研技术服务", "应用技术服务", "科研成果转化", "科学产品销售" ]等。公司奉行顾客至上、质量为首、的经营宗旨，深受客户好评。目前公司已经成为[ "科研技术服务", "应用技术服务", "科研成果转化", "科学产品销售" ]的**企业，正积蓄着更大的能量，向更广阔的空间、更***的领域拓展。

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