是分泌性蛋白检测优先方法之一。下面介绍下免疫组化方法的具体实验流程步骤。实验流程简介一、SP三步法1）石蜡切片，常规脱蜡至水。2)（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次.5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（比较好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。8)PBS冲洗，3分钟×5次。9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟-1h。10)PBS冲洗，3分钟×5次。11）显色剂显色（DAB等）。12）自来水充分冲洗。13）可进行复染，脱水，透明。14）选择适当的封片剂封片。二、即用型二步法1）脱蜡、水化组织切片。2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。3)，以阻断内源性过氧化物酶，上海七色免疫组化，PBS或TBS冲洗，上海七色免疫组化。4）滴加一抗，上海七色免疫组化，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。5）滴加enhangcer增强剂，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。上海七色免疫组化

TSA技术(Tyramide Signal Amplification™，酪胺信号放大技术)是做多重免疫荧光染色的一种多快好省的方法，它使同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体，搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数**增强。如果想要运用这个技术，需要先做四个方面的准备工作：严格验证的高特异性抗体：所有CST的IHC-P验证过的抗体都满足mIHC(多重荧光免疫组化)高特异性的要求;HRP偶联的针对一抗种属亚型特异的二抗;酪胺荧光素(Perkin Elmer,Thermo Fisher Scientific等供应商);多光谱成像系统(PerkinElmer等)。上海七色免疫组化

    ·若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。直接免疫荧光法的注意事项(续)·一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；·经荧光染色的标本比较好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。(2)间接法又称为荧光抗-抗体法需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。–可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。间接免疫荧光法操作步骤·标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；·一抗染色：–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用)，37C作用30min或4C过夜。·PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；间接免疫荧光法操作步骤(续)·加荧光标记的二抗抗体，37C湿盒避光作用30min。·PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；·甘油缓冲液封片·镜检·优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；·缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。间接免疫荧光法的注意事项·荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h。

    –缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。(3)微波照射法·将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。·此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。(4)高压加热法暴露抗原·将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3min，可取得极好的效果。·由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。(1)酸水解法·酸水解可使交联断裂、暴露抗原。·将玻片浸入1mol/LHCl溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。·此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。加热法的注意事项·达到规定的温度(92～95C以上)；·维持一定的时间；·避免切片干涸(抗原可能完全丢失)；·加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；·修复液：–**常用的是；–***研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液()。4、载玻片的处理·抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防预防脱发片，常用粘附剂处理载玻片。

    免疫组化细胞凋亡检测细胞凋亡原理：正常凋亡细胞通过检测凋亡细胞DNA片段进行染色，正常的、人为造成凋亡的细胞很少能够被染色。以甲基绿复染，便于从形态学上分辨评估正常细胞和凋亡细胞。首先确定目标凋亡细胞的组织部位（如眼球组织，由于玻璃体结构内没有细胞核，因此看不到凋亡，在整个组织的**外面有单层视网膜细胞，因此只能在**边缘查看凋亡细胞的阳性产物）免疫组化关于掉片HE、Masson、番红O、Nissl、Mallory等染色方法很少有掉片现象；免疫组化和细胞凋亡检测我们采用专门购买的防脱片，由于整个实验流程比较长，在实验过程中产生掉片是很正常的现象。对于容易掉片的组织，如：骨组织、脑组织、皮肤组织等掉片有时候是不可避免的。免疫组化经验总结编辑做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，**终结果未能达到预期的效果。经过一段时间的浏览和学习，从一些在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法。北京四色免疫组化分析服务

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    在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸-氨基反应而标记在蛋白分子上。(4)碘化丙啶(PI)·是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。·PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。·比较大吸收光谱是493nm，比较大发射光谱是630nm，呈红色荧光。2、荧光抗体的保存·一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。–一般认为0～4C可保存1～2年，-20C可保存3～4年。–要小量分装，防止反复冻融。–保存前需加防腐剂(浓度为1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000叠氮化钠)。3、免疫荧光的染色方法·免疫荧光染色法常用的有–直接法–间接法原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应(用来检测未知抗原)。直接免疫荧光法的操作步骤·标本的处理：–细胞涂片、细胞爬片浸入冷**或4%的多聚甲醛固定10min，然后用PBST(含pH)漂洗5min×3/次；–石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用PBST漂洗5min×3/次；·2%BSA或10%BSA37C湿盒内封闭30min·抗体染色：–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37C孵育30min；直接免疫荧光法的操作步骤(续)·PBS。上海七色免疫组化

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