三、蛋白质分子量的测定 蛋白质分子量测定的方法很多，目前常用的方法有以下几种。 3.1 凝胶过滤法 凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理如“分离纯化方法”中所 述，蛋白纯化系统。一定型号的凝胶颗粒上具有一定大小的孔隙，只允许较小的分子进入胶粒，而大于孔隙的分子则不能进入胶粒而被排阻在胶粒外面。用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱下来，随后能够进入颗粒的蛋白质也按分子量大小而先后被洗脱下来，分子量越小的越后被洗脱下来。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准进行层析分析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，蛋白纯化系统，蛋白纯化系统，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行层析分析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量来。蛋白纯化系统

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蛋白质分离纯化步骤（二） 2.4.3. 亲和层析 亲和层析（affinity-chromatography）分离技术是根据许多蛋白质对特定的化学基团具有专一性结合的原理。这些能被生物大分子如蛋白质所识别并与之结合的基团称为配基或配体（ligand）。亲和层析是一种极有效的分离纯化蛋白质的方法。例如酶对它的底物具有特殊的亲和力；抗原和抗体互为配基。以伴刀豆球蛋白A（concanavalin A）的分离纯化为例，由于该蛋白对葡萄糖有专一性亲和吸附，因此可把葡萄糖通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面上。为了防止载体表面的空间位阻影响待分离的蛋白质大分子与其配基的结合，在配基和载体之间往往插入一段所谓的连接臂（或称为间隔臂，spacerarm），使配体与载体之间保持足够的距离。 将这种多糖颗粒装入一定规格的玻璃管中就制成了一根亲和层析柱。当含有伴刀豆球蛋白的提取液加到层析柱的上部，并沿柱从上往下过时，待纯化的蛋白质与其特异性配基结合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能与葡萄糖配基结合将通过柱子而流出（图2-28a）。然后采用一定的洗脱条件，如浓的葡萄糖溶液进行洗脱，即可把该蛋白质洗脱下来，达到与其它蛋白质分离的目的。

蛋白质分离纯化步骤（二） 2.4.2 纤维素柱层析法 该法是利用蛋白质的酸碱性质作为分离的基础。离子交换纤维素（cellulose ion-exchanger）是人工合成的纤维素衍生物，它具有松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，使蛋白质大分子可以自由通过。因此常用于蛋白质的分离。 （1）羧甲基纤维素（CM-纤维素） 在纤维素颗粒上带有羧甲基基团。在中性pH条件下，羧甲基上的质子可解离下来（图2-27a），而溶液中带正电荷的蛋白质分子可与纤维素颗粒上的羧甲基负电荷结合。可交换的基团带正电，因此是一种阳离子交换剂。蛋白质与离子交换纤维素之间结合能力的大小取决于彼此间相反电荷基团之间静电吸引。 (2）二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素） 在中性pH条件下，它含有带正电荷的基团，可与溶液中的带负电荷的蛋白质结合，可交换的基团带负电荷，因此是一种阴离子交换剂。当某一蛋白质混合溶液通过装有DEAE-纤维素的层析柱时，带正电荷的蛋白质不能结合而随着洗脱液的流动先被洗脱下来。带负电荷的蛋白质将被结合到柱上。结合力取决于彼此相反电荷基团间的静电吸引。然后选用一定pH和离子强度的缓冲液进行洗脱，改变蛋白质分子所带的静电荷，依次从层析柱流出达到相互分离的目的。

蛋白质分离纯化步骤（二） 2.4 样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。 1. 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析（gel-filtration chromatography）又称为分子排阻层析或分子筛层析。它是将葡聚糖凝胶（Sephadex）装入一个柱子中，制成凝胶柱。这种凝胶颗粒具有网状结构，不同类型凝胶的网孔大小不同。当把蛋白质混合样品加到凝胶柱中时，比凝胶网孔小的蛋白质可进入网孔内，而大于网孔的分子则不能进入被排阻在凝胶颗粒之外。当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质直接通过凝胶之间的缝隙先被洗脱下来，而比网孔小的蛋白质可连续不断地进入网孔内。这样的小分子不但流经的路程长，而且受到来自凝胶内部的阻力也很大，所以蛋白质越小，从柱子上洗脱下来所需时间越长。由于不同蛋白质的分子大小不同，进入网孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脱所用体积及时间不同，从而达到分离的目的。直销蛋白纯化系统厂家报价

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