DNA和RNA提取方法一、DNA的提取(方法一)1.实验试剂(1)DNA提取液:Tris HCl(pH),NaCl,EDTA,1％SDS(2)3MNaAc(3)TE:10mmol/LTris-HClmmol/LEDTA(4)酚():氯仿:异戊醇(25:24:1)(5)氯仿:异戊醇(24:1)(6)异丙醇(7)无水乙醇(8)75%乙醇(9)RNaseA2.实验步骤(1)取菌丝,在液氮中迅速研磨成粉(2)加入4mL提取液,快速振荡混匀(3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3～5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本)(4)1000rpm,4℃,5min(5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃离心5min)(6)取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或,混匀,静置约30min(7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ulTE中(8)加入1ulRNaseA(10mg/mL),37℃处理1h(9)用酚():氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)(10)取上清,1/10V3MNaAc,℃沉淀30min以上(11)沉淀用75%乙醇漂洗，海南好RNA合成仪哪里有，海南好RNA合成仪哪里有,风干,溶于200ulTE中,-20℃保存备用二，海南好RNA合成仪哪里有、DNA的提取(方法二)1.菌丝2.加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次3.加入1mL5MKAc,冰浴20min4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)5.取上清。含试剂瓶组中压力加压到规定气压。海南好RNA合成仪哪里有
转膜仪是用来转印蛋白的仪器。电泳转印为转移蛋白zui常用的方法，该技术有效、迅速，并且使得蛋白在凝胶中保持**辨率。在凝胶中向印迹膜载体转印分离的蛋白质的过程，即是电泳转印法。因为此技术往膜上转印蛋白***、快速和准确，并且能够使得蛋白在凝胶中保持**辨率。，因此在转移印迹技术中得到***的应用。注意事项：1.缓冲液的准备非常重要。除非另有说明，否则请勿通过添加酸或碱来调节转移缓冲液ph。缓冲液的准备不当会导致过热和安全***。*使用质量试剂等级甲醇。污染的甲醇可导致转移缓冲液电导率增加，以及大分子的转移不良。2.电泳后，在转移缓冲液中平衡凝胶。平衡有助于去除电泳缓冲液和去污剂。如果不去除盐，它们将增加转移缓冲液的电导率和转移过程中产生的热量。同样，低百分比的凝胶（<12％丙烯酰胺）会在含甲醇的缓冲液中收缩。平衡允许凝胶在电泳转移之前调节至其最终尺寸。平衡所需的时间长短取决于凝胶厚度。例如，对于，需要15分钟。低分子量大分子10，000道尔顿）可能更容易从凝胶中扩散出来。通过在电泳过程中多次改变预平衡缓冲液，可以允许适当的凝胶预平衡。预平衡期相对较短。这将有助于限制低分子量大分子的扩散，同时提供有效的减盐效果。海南好RNA合成仪哪里有所有压力管路均采用特氟龙导管，直径为1/16—1/8吋。
对合成的引物先进行稀释，现将方法简单叙述如下：：OligoDNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为，则一条OligoDNA的分子量=碱基数×。例：您得到一管标为5OD260的20merOligoDNA分子量=20×质量数=5×33=165μg摩尔数=165/6490=μmol=25nmol若加除菌双蒸水400μl溶解，则浓度为25nmol/400μl=μ，这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1OD260单位，根据此定义，1OD260单位相当于33μg的OligoDNA，您可以根据此数据和您的OligoDNA分子量，计算得到摩尔数以计算不同摩尔浓度的溶液。3.引物序列的分子量计算公式如下：MW=（A碱基数×312）+（C碱基数×288）+（G碱基数×328）+（T碱基数×303）-61例如：引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACGA=1C=3G=11T=6MW=（1×312）+（3×328）+（6×303）-61=65414.装有引物的eppendorf管一般保存于-20℃，临用前稀释。5.由于OligoDNA呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前请先离心10,000rpm,1min,然后再慢慢打开管盖。6.在装有引物的eppendorf管内加入100-500μl双蒸水，盖上管盖，充分上下振荡5-10分钟，再次离心10,000rpm,1min。7.计算原引物管primer的浓度。
最初是sanger法，后来发展了几种高通量测序方法1sanger法：双脱氧测序的原理，DNA合成时加上一个ddNTP从而终止这条链的延伸，毛细管电泳读取分析序列。一般教材讲的都是这种方法，经典，读长800bp，但是通量小成本高。2454：也称焦磷酸测序，一个run下来约400M的数据量。将emulsionPCR产物连磁珠上，放入PicoTiterPlate，测序反应是通过释放PPi经过ATP***化酶和荧光素酶作用发光D捕捉拍照，反应是连续的，所以遇到连续的碱基如polyA时，454易产生误差。3Solexa：边合成边测序，将DNA单链固定在芯片上，合成DNA簇，是一种可逆阻断的合成反应，每个循环只加上一个碱基、系统拍照一次。通过读取拍照信号分析序列，一个run约200个G数据量以上。目前能量比较高，不足是读长短，现在有PE150，可以测通300bp。4Soild：与454有相似之处，该方法更精细，磁珠富集，磁珠更小，密度更高。它的独特之处是连接反应测序，加入8碱基荧光单链混合物。一次测序读两个碱基，获得颜色编码组成的碱基序列，通过几轮反应最终得出序列。5Iontorrent：特点是小巧。试剂通过集成的流体通路进入芯片中，密布于芯片上的反应孔立即成为上百万个微反应体系。软件控制合成的所有必要操作并由微处理机来解释和执行。
13)如果分部收集器用来收集每个DMT脱保护步骤的流出物，确保试管充分清洁干净，并打开分部收集器，确保DMT废液管路通向分部收集器。14)启动循环，运行开始程序清洗试剂管路，除去原来的试剂。注意：TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个DMT，并将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个DMT，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中；TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中。DNA合成仪日常维护编辑1．瓶塞“O”形环一月检查一次“O”形环，最少1年更换1次。将新的备用“O”形环与仪器上的相比较，如果在“O”形环上出现白色沉淀，用棉花蘸取乙腈，进行清洗。更换“O”形环的步骤如下：用止血钳夹住“O”形环，从槽中取下(或用牙签钩下)，注意不要损坏托住“O”形环的白色聚氟乙烯插塞(tefloninsert)；确保插塞上没有颗粒后，用手指将新“O”形环推进槽，进行压力实验。废液瓶是输送系统的低压侧，必须将出口与大气相通。海南好RNA合成仪哪里有
合成信息显示在液晶显示屏上，通过选择键板上的键可与仪器交流。海南好RNA合成仪哪里有
11、为了确保合成仪上合成柱处于正确的位置，运行StartColumn步骤对每一个柱的位置进行检查。12、对是否充满连接在合成仪上的溶剂残留(废液瓶)进行检查。13、保证试管充分清洁干净，保证DMT废液管路通向分部收集器。14、将循环启动，运行开始程序对试剂管路进行清洗，将原来的试剂除去。日常维护1．流路节流阀应该1个月清洗1次节流阀，以避免阻塞，清洗时，先在水中煮沸15min，然后再在甲醇中超声波清洗。2．储液瓶需要保持氩气压力以及管路清洁。瓶子在亚磷酰胺及储液瓶位置上放置。3．瓶塞“O”形环zhi少对“O”形环一月检查一次，1年更换1次。比较仪器上的“O”形环与新的备用“O”形环，若有白色沉淀出现在“O”形环上，用棉花蘸取乙腈进行清洗。海南好RNA合成仪哪里有
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