标准品浓度分别为1×108、1×107、1×106、1×105，江夏区细小病菌联系方式、1×104、1×103copies/μl。检测结束后，以各标准品的浓度log值(x轴)对其相应ct值(y轴)作图，绘制标准曲线，标准曲线如图3所示，其中cav2相关系数为r2＝，误差较小，标准曲线可用，由标准曲线得到的线性方程为：y＝，cdv相关系数为r2＝，误差较小，标准曲线可用，由标准曲线得到的线性方程为：y＝，cpv相关系数为r2＝，误差较小，标准曲线可用，由标准曲线得到的线性方程为：y＝，cpiv相关系数为r2＝，误差较小，标准曲线可用，由标准曲线得到的线性方程为：y＝。因此标准曲线可用于对cav-ii，江夏区细小病菌联系方式、cpv、cdv和cpiv进行四重实时荧光定量pcr检测。、对cav-ii、cpv、cdv和cpiv进行四重实时荧光定量pcr检测用本发明的四重实时荧光定量pcr检测方法对从金宇保灵生物药品有限公司疫苗研究室收集的10份犬源病料(待测样品)提取的dna或rna(检测样)进行检测，以灭活的cav-ii、cpv、cdv和cpiv细胞培养物提取的dna或rna为阳性对照样，以无酶水为阴性对照样，根据实时荧光定量pcr检测结果，对样本中cav-ii、cpv，江夏区细小病菌联系方式、cdv和cpiv进行定性判定，并对bingdu的拷贝数进行定量。具体检测方法包括以下步骤：1)以从待测样品中提取的基因组dna或rna为模板。

    本发明属于生物检测技术领域：中的兽医动物病原检测，具体涉及一种用于犬腺bingduii型、犬瘟热bingdu、犬细小bingdu和犬副流感bingdu的四重实时荧光定量pcr检测方法、检测试剂盒及其**引物和taqman探针。背景技术：：犬瘟热bingdu(caninedistempervirus，cdv)、犬细小bingdu(canineprvovirus，cpv)、犬副流感bingdu(canineparainfluenzavirus，cpiv)和犬腺bingduii型(canineadenovirusii，cav-ii)是犬bingdu性传染病暴发和流行的主要病原体。cdv染上引起的犬瘟热主要有呼吸型、消化型、神经型和混合型4种，cdv染上可引起全身性的免疫压制，病死率极高。cpv主要引起犬的急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎。cpiv染上主要引起犬的呼吸道疾病，是犬传染性呼吸系统疾病重要的病原之一。cav-ii型引起与呼吸道疾病和肠炎相关的犬接触性呼吸道疾病，但不引起肺炎症状，可引起幼犬咳嗽又叫犬窝咳。这四种bingdu单一染上或混合染上均可给养犬业带来严重的打击，四种犬病原临床症状较为相似，且常伴有混合染上，给临床诊断造成了一定的困难。文献cna建立了用于同时检测犬瘟热bingdu、犬细小bingdu、i型和ii型犬腺bingdu的多重pcr检测引物。

    预先配置含1％冰乙酸的异丙醇和在试剂bufferw1a和bufferw2中添加指定浓度的无水乙醇。(2)在μl的待测样品，并加入200μlbufferv-l，漩涡震荡混匀后，静置5min。(3)在步骤(2)的μlbufferv-n，漩涡震荡混匀，12000g离心5min。(4)将步骤(3)离心管中上清转移至2ml离心管(试剂盒内提供)中，加300μl异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀。(5)将制备管置于2ml离心管中(试剂盒内提供)中，取步骤(4)的混合液移入制备管中，6000g离心1min。(6)弃滤液，将制备管置回至2ml离心管中，加500μlbufferw1a，室温静置1min。12000g离心1min。(7)弃滤液，将制备管置回至2ml离心管中，加800μlbufferw2，12000g离心1min。(8)将制备管置回到2ml离心管中，12000g离心1min。(9)将制备管置于洁净的(试剂盒内提供)中，在制备管膜**加40μl无酶水，室温静置1min。12000g离心1min洗脱rna。从待测样品中提取的dna或rna作为检测样；从cav-ii、cpv、cdv和cpiv细胞培养物中提取的dna或rna作为阳性对照样；按照下述方法将从cav-ii、cpv、cdv和cpiv细胞培养物中提取的dna或rna制备获得标准品。、四重实时荧光定量pcr标准曲线的建立、pcr扩增靶标序列使用实施例1中4对特异性引物。

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