25mmol/LTris、192mmol/LGlycine、20%甲醇)，100V恒压lh，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(含mol/LTBS、)室温洗3次，浸入封闭液(含2%BSA的TBST)中37°C，1h，洗涤液(TBST)室温洗3次，加山羊抗人(Santacruze公司)，37'C孵育1h，TBST室温洗膜3次，加入兔抗山羊IgG-HRP二抗(中杉公司)，37。C孵育1h，TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入OPD显色液中，室温避光显色10min，蒸馏水冲洗终止反应(参见图3)。(3)融合蛋白的纯化和复性取含，5000rpm离心10min，收菌，超声裂菌；4°C,12000rpm，离心20min，分别收集上清液和沉淀。将沉淀用6mol/L尿素溶液重悬，4'C下静置溶解。将溶解的沉淀和上清分别取样进行SDS-PAGE电泳，对目的蛋白的表达形式进行分析。在证实目的蛋白以包涵体的形式表达后，用Ni-NTA柱亲和层析纯化所溶解的沉淀(包涵体)。按1g菌体加10mL裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌。12000rpm,离心15min，弃上清，1g沉淀加10mL6M尿素，，MTris(pH)。4"C搅拌2h，12000rpm，离心15min，共离心2次，天津高特异人源Claudin18.2蛋白全国发货，天津高特异人源Claudin18.2蛋白全国发货，天津高特异人源Claudin18.2蛋白全国发货，收集上清待用。用6M尿素，MNaH2P04，MTris()充分平衡Ni柱，先用含10mmo1咪唑的6M尿素，,()洗脱杂蛋白。

    一般需要盐类(硝酸盐、氯化物、葡聚糖***盐等)、电场、多聚化合物(聚乙二醇、聚乙烯醇等)[7]等外界诱导或刺激来有效地促进融合，而融合模型的理性设计与后续的突变菌筛选密不可分，对目标菌种的定向进化有直接影响。以原生质体灭活融合为例，在利用物理或化学方法损伤原生质体生理结构使其失去再生能力后，只有采取不同机制(高温灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活等)灭活的亲本之间才能发生互补融合并恢复再生，因此该融合模型十分适用于缺少遗传标记和***表型的亲本[8]。作为基因组重排的**过程，原生质体融合可以突破种属间界限，极大地扩充了基因组重排的范畴和多样性；(4)基因组重排突变菌的***筛选和验证。主要是基于融合模型中不同亲本的差异化特性(如***抗性、发酵环境耐受性、产量差异等)进行针对性的筛选，从而在融合子中富集多种有益的突变。目前常用方法主要包括互补筛选(营养缺点型互补、抗性互补、代谢互补***)、差异筛选(物理特性、生理特性、不同抗性)、荧光标记筛选[9]等，其中***抗性和包括酸碱、温度、化合物(底物、产物和副产物等)等在内的条件耐受性，因其鲜明的筛选标记近来在基因组重排的筛选中广为应用[10-12]。在筛选到目标融合子后。

    其序列的一致性为，该结果表明它们在进化上呈功能高度保守性。Claudin的分子质量为22-27kD。每一个Claudin分子均具有相同的结构，其肽链包含有4个跨膜区、2个细胞外环形结构和位于胞质中的羧基端、氨基端。第l和第4个跨膜区以及第2个细胞外环的氨基酸序列具有高度保守性。第4个跨膜区对闭锁蛋白准确定位于紧密连接起重要的作用，若丢失将会导致闭锁蛋白的羧基末端错位到细胞外间隙。两个细胞外环参与同种或异种Claudin蛋白之间的结合，对紧密连接条带形成和离子通透选择性具有重要作用。Claiidins***分布于正常组织和不同**组织，且存在差异性的表达。研究其在**发生、生长和转移过程中的作用是近年的一个热点。近年，在胃*前病变和胃*中也发现几种claudins蛋白表达异常，并与预后有关。现实生活中，8胃*、胰腺*、食道*以及转移和未转移卵巢*免疫***中存在着手术切除复发率高、化疗和放疗毒副作用强以及单抗***费用高的问题，迫切需要新的技术产生，而通过对claudins在胃*中异常分布和表达的研究，人们能更好得理解胃*的发***展机制，从而有利于胃*的诊断和***。Claudins在胃*前病变、胃*各期和各型中的表达的研究是近年热点。

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