·若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，北京四色免疫组化技术服务，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。直接免疫荧光法的注意事项(续)·一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；·经荧光染色的标本比较好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。(2)间接法又称为荧光抗-抗体法需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。–可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。间接免疫荧光法操作步骤·标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；·一抗染色：–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用)，37C作用30min或4C过夜。·PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；间接免疫荧光法操作步骤(续)·加荧光标记的二抗抗体，37C湿盒避光作用30min。·PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；·甘油缓冲液封片·镜检·优点：敏感性较高，北京四色免疫组化技术服务，北京四色免疫组化技术服务，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；·缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。间接免疫荧光法的注意事项·荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h。

    ·目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。(2)碱性磷酸酶(AP)及底物·AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：–偶氮偶联反应，底物为-萘酚磷酸盐，经水解后得-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fastblue)或坚牢红(fastred)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。–靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodylphosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。2、常用的免疫酶染色方法·又分为以下两种方法：–酶标抗体法·直接法·间接法–非标记抗体酶法·酶桥法·PAP法(1)酶标抗体法·通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。–优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。–缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。(1)酶标抗体法——直接法·将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，***用底物显色剂显色。(1)酶标抗体法——间接法·将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合。

    ⑴抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重（有文献支持），此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。⑵石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。⑶组织切片中本身抗原含量的多少？这方面我有教训的，我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定，用1：200一抗效果很好；但我用1：200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几乎呈阴性，后来证实是因为两者抗原含量相差甚远，则一抗也要适当提高浓度。2、其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。⑴一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的speciesreactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。⑵抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4℃孵育过夜和37℃复温45min；二抗我一般37℃30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。⑶抗体浓度过低。这是阴性结果的**可能原因。必须提高稀释度。

免责声明： 本页面所展现的信息及其他相关推荐信息，均来源于其对应的用户，本网对此不承担任何保证责任。如涉及作品内容、 版权和其他问题，请及时与本网联系，我们将核实后进行删除，本网站对此声明具有最终解释权。