多重荧光免疫组化染色技术

免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，随着免疫zhiliao的崛起，越来越多**微环境种的标志物被发现与疾病zhiliao、进展密切相关，对这些标志物进行同时染色标记、并研究它们之间的共定位、表达量和距离关系成为肿瘤免疫研究的普遍需求。

酪氨信号放大技术原理

类似常规免疫组化的DAB显色法，TSA（Tyramide signal amplification）技术同样采用HRP标记的二抗，上海多靶点免疫组化技术服务，上海多靶点免疫组化技术服务，上海多靶点免疫组化技术服务，HRP催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

    ·免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1混合乳化后(油包水)注入动物。–一般***注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。佐剂与抗原乳化的方法·研磨法：适于制备大量的佐剂抗原–先将不完全佐剂加热，取；缓缓滴入，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。–按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。·缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法(续)·注射器混合法–将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。·优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。·缺点：不易乳化，时间长。佐剂与抗原乳化的方法(续)·快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。–将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下，离瓶底，以免打碎离心管。–每次乳化10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。·优点：简单、快速、节省材料。

    6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟×5次。7）应用DAB溶液显色。8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。三、免疫荧光技术（略）1、酶免疫组化的关键环节1）标本固定固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouin’s液或mDF液效果较好。2）脱水、石蜡包埋和制片脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。3）脱蜡和水化这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分别10min（这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的），但当天制好的切片一般先60℃3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。4）抗原修复由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露。

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