EBV细胞永生化实验步骤1、淋巴细胞分离液：避光4度保存，用前在37度水浴中加温。整个分离过程中，温度应控制在8-28度，温度过高或过低均影响分离质量。2、全培养基（用前配置）：RPM1640培养基，内含20%胎牛血清（Gibco）{56℃灭活30分钟}，1M的HEPES，，1%青霉素和链霉素。3、环胞酶素A（CyA）：5ml(250mg)/瓶，用1640培养基稀释成，使用时终浓度为2ug/ml()。4、EBV液购自中国科学院遗传所，储存于零下80度，江苏EBV法细胞永生化构建服务。使用时从冰箱中取出，37度迅速融化，用，江苏EBV法细胞永生化构建服务，不要超过。二、建株方法1，江苏EBV法细胞永生化构建服务、取外周血3-4ml，肝素抗凝（血液室温可放置48小时），应用液浓度5u/ml，可加入5-10ml外周血。2、将血液与等量1640培养液混匀后，沿管壁渐渐加入到含有4ml淋巴细胞分离液的离心管中（混合血：淋巴细胞分离液=6：4），3000转离心10分钟。3、吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入不含血清的1640培养液6ml，轻轻混匀，进行次洗涤。1500转离心15分钟。

    5×100000cells/瓶Cs-(004)-006848家猪皮肤细胞；SSC-S1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006849小香猪皮肤细胞；SSC-S2，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006850家猫肺细胞；FCA-L1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006851家猫肺细胞；FCA-L2，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006852家猫皮肤细胞；FCA-S1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006853大耳山羊肺细胞；LDG-1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006854大耳山羊肾细胞；LDG-2，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006855大耳山羊肾细胞；LDG-3，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006856绵羊肺细胞；OAR-L1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006857绵羊皮肤细胞；OAR-S1，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006858恒河猴肾细胞；RM-2，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006859马铁菊头蝠肺细胞；GHBL3，规格：>5×100000cells/瓶Cs-(004)-006860恒河猴肾细胞；RM-3，规格：>。

细胞永生化(cell immortalization) 指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过程. 自发永生化的几率非常小, 啮齿类动物为10-5~10-6, 而人类细胞则更为罕见, 小于10-12.  通过基因转染等技术将外源性永生化基因, 如、原*基因和抑*基因突变体等, 导入目的细胞内, 以增加永生化的发生率, 进而建立永生化细胞株(immortalized cell strains), 以达到使体外培养的细胞具有无限 增殖能力且细胞间无差异的目的。细胞永生化的研究意义：了解细胞增殖与衰老的分子机制；为研究**、控制肿瘤细胞增殖以及移植等奠定基础；可使传代困难、增殖慢、易衰老的细胞获得永生，获得更多的细胞资源。SV40 Large T （SV40大T抗原）的温度敏感突变株tsA58表达的蛋白在允许温度（permissive temperature）33℃下有活性，在非允许温度（non-permissive temperature）39℃下失活，因而用SV40 Large T (tsA58) 永生化的细胞系具有永生化和温控性双重特性。

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