时间过长，会使荧光减弱，上海多标记免疫组化染色服务。·每次试验时，需设置以下三种对照：–阳性对照：阳性血清+荧光标记物–阴性对照：阴性血清+荧光标记物–荧光标记物对照：PBS+荧光标记物间接免疫荧光法的注意事项(续)·标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。·一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。免疫细胞化学技术免疫酶酶标法【原理】·以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位；·酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。1、常用的标记酶及其显色底物·辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，上海多标记免疫组化染色服务,HRP)及底物·碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)及底物(1)辣根过氧化物酶(HRP)及底物·HRP是应用**广的一种酶，上海多标记免疫组化染色服务，来源于植物辣根，由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约40kDa，稳定性好；·底物为过氧化物和供氢体(DH2)–过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。–供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化型染料，**常用的供氢体是DAB。DAB(二氨基联苯胺)·DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，**为常用。

    因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。·乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。(3)其它固定剂·**：–对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用**固定。3、抗原修复——原因·常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：–抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；–蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。·要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。3、抗原修复——方法·化学方法·加热方法–水浴加热法–微波照射法–高压加热法–酸水解法(1)化学方法·主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。–胰蛋白酶：一般使用浓度为～，消化时间为37C，10～40**要用于细胞内抗原的显示；–胃蛋白酶：一般使用浓度为～，消化时间为37C、30～180**要用于细胞间质抗原的显示。·例如：Laminin、CollagenIV(2)水浴加热法·将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。–优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室。

    中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享下。免疫组化实验为例从我接触的很多本科生和研究生中发现，他们的确是免疫组化“新手”，他们只注重如何做和**终的结果，但对为什么这样做不太感兴趣。他们常按照网上所说的方法，摸索好的抗体浓度和条件后做出很漂亮的染色结果后，他们就认为自己已经掌握了免疫组化方法了，结果不求上进，更换一种新抗体后或实验出现异常结果后就很难做出来了。当然，免疫组化对于我来说，做过很多，但也不能说什么都会，只不过我做的多了，失败多了和思考多了，可能比新手多了解一些其中的诀窍，拿来与大家进行分享。此外，我个人经验不可能面面俱到，还需要更多有经验的高手一起分享、纠正和补充。在这里，我需要感谢中华病理网、丁香通、小木虫论坛给我很大的帮助，还有上海舜田生物技术人员老师给我实验很多指导和帮助，让我受益匪浅。免疫组化免疫个人感悟1、其实免疫组化，我个人感觉方法和操作都不是很难，关键是结果出现异常时该如何去解决？我认为首先需要掌握好免疫组化实验的原理，知道每一个操作步骤的目的。

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