–缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。(3)微波照射法·将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。·此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，上海多色荧光免疫组化技术服务，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。(4)高压加热法暴露抗原·将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3min，可取得极好的效果。·由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。(1)酸水解法·酸水解可使交联断裂、暴露抗原。·将玻片浸入1mol/LHCl溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。·此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。加热法的注意事项·达到规定的温度(92～95C以上)；·维持一定的时间；·避免切片干涸(抗原可能完全丢失)；·加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；·修复液：–**常用的是；–***研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液()。4、载玻片的处理·抗原修复过程中，上海多色荧光免疫组化技术服务，上海多色荧光免疫组化技术服务，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防预防脱发片，常用粘附剂处理载玻片。

    形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，***用底物显色剂显色。酶标抗体间接法的操作步骤·标本准备：–石蜡脱蜡至水；–冰冻切片浸入4C**固定10min，PBST漂洗，5min×3；–细胞爬片先用PBS洗，然后4C**固定10min，再PBST漂洗，5min×3；·石蜡切片需要进行抗原修复，其它标本则不用；(2)酶标抗体间接法的操作步骤(续)·封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2-甲醇溶液室温孵育5～10min(湿盒内)；·PBST漂洗，5min×3；·5～10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育30min(湿盒内)；·倾去血清勿洗，加1%BSA(PBST配制)稀释的一抗，37C孵育60min或4C过夜(湿盒内)；(2)酶标抗体间接法的操作步骤(续)·PBST漂洗，5min×3；·加HRP标记的二抗室温孵育lh或37C30min；·加(显色液应新鲜配置)；·经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。(2)非标记抗体酶法——酶桥法·首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；·以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上；·再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布–优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。

    3、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。比较大激发光波长为550nm；比较大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。4、花青类染料常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。5、乙酸甲酯其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用**多的细胞内pH荧光指示剂。比较大激发光波长为505nm，比较大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。

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