免疫印迹法（immunoblotting ）因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southern

blot相类似，亦被称为Western blot。免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的辨力与抗原抗体反应的特异性相结合，北京**白Western Blot技术服务。典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，北京**白Western Blot技术服务，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率，北京**白Western Blot技术服务、分辨率和灵敏度，使其成为使用**的免疫化学方法之一。

全自动western  blot无需凝胶、无需转印，放入您的样品，按个按钮，然后就没事了。首先，将样品与Simple

Western样品缓冲液混合，至终浓度1 μg/μL，还原并变性，然后将制备好的样品、一抗和二抗、化学发光底物分配到384孔分析板的指定孔中。之后，将Simple

Western分析缓冲液、毛细管和制备好的分析板放入Simon内，它自动开展所有分析步骤。当蛋白沿着毛细管内一个堆积和分离基质迁移时，它们分离。分离后的蛋白固定到毛细管壁上。之后利用一抗鉴定目标蛋白，用HRP结合的二抗和化学发光底物检测蛋白。系统自动报告检测蛋白的分子量和信号。每次实验可同时分析**多12个样品，结果可在3-5小时内获得。15-150 kDa的目标蛋白均可检测。软件报告每个检测蛋白的分子量、面积、面积百分比和信噪比。对于传统的Western blot而言，结果的重复性一直是个挑战，因为缺乏标准化的操作，且多个操作步骤引入了实验可变性。而Simple Western分析是完全自动化的，因此结果的重复性更好。整体的定量也**改善了，因为省去了转印步骤，从而避免了蛋白转移的不一致。

转膜(Transfer)

推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。

通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，比较好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量比较大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

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