转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，上海微量蛋白Western Blot检测服务，否则极易产生较高的背景。用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。使用

ECL化学发光试剂来检测蛋白。压片可以采用**的压片暗盒进行。洗片时可以使用X光片自动洗片机，上海微量蛋白Western Blot检测服务，上海微量蛋白Western Blot检测服务。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用柯达原装的生物实验**柯达X-OMAT BT胶片。

(1) SDS-PAGE凝胶配制 

SDS-PAGE凝胶可以使用商业生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。

(2) 样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 

(3) 上样与电泳：冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，比较好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

全自动western  blot无需凝胶、无需转印，放入您的样品，按个按钮，然后就没事了。首先，将样品与Simple

Western样品缓冲液混合，至终浓度1 μg/μL，还原并变性，然后将制备好的样品、一抗和二抗、化学发光底物分配到384孔分析板的指定孔中。之后，将Simple

Western分析缓冲液、毛细管和制备好的分析板放入Simon内，它自动开展所有分析步骤。当蛋白沿着毛细管内一个堆积和分离基质迁移时，它们分离。分离后的蛋白固定到毛细管壁上。之后利用一抗鉴定目标蛋白，用HRP结合的二抗和化学发光底物检测蛋白。系统自动报告检测蛋白的分子量和信号。每次实验可同时分析**多12个样品，结果可在3-5小时内获得。15-150 kDa的目标蛋白均可检测。软件报告每个检测蛋白的分子量、面积、面积百分比和信噪比。对于传统的Western blot而言，结果的重复性一直是个挑战，因为缺乏标准化的操作，且多个操作步骤引入了实验可变性。而Simple Western分析是完全自动化的，因此结果的重复性更好。整体的定量也**改善了，因为省去了转印步骤，从而避免了蛋白转移的不一致。

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