寡核苷酸探针的非放射性标记时,可用以下几种方法:1.酶延伸法合成与探针目的基因的3’-端一段互补的寡核苷核序列,北京操作性能好寡核苷酸合成仪对比价,此序列的5’-端多加一个A,与目的基因片段退火,再用Klenow酶延伸,使bio–dUTP掺入探针的3’末端。2.5’磷酸末端标记法带5’-磷酸的寡核苷酸探针,在咪唑缓冲液中用水溶性碳二亚胺(EDC)处理,可生成活性的磷酸咪唑中间体,与过量的乙二胺作用,就可以引入一个带氨基的接臂。用活化生物素标记就可以得到5’-磷酸标记的寡核苷酸探针。3.酶标探针法用双功能联接剂如辛二酸双羟基琥珀亚胺酯联接寡核苷酸和碱磷酶,可以生成1:1的酶标寡核苷酸探针。此法省略了生物素-亲合素中间步骤,可减少非特异性反应。4.生物素酰肼胞嘧啶修饰法在亚liusuan盐催化下,北京操作性能好寡核苷酸合成仪对比价,生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基而得生物素化寡核苷酸探针。5.寡核苷酸的酶促加尾标记法在末端转移酶的作用下,用非放射性物质修饰的核苷酸(生物素dATP;生物素-dUTP;地高辛-dUTP)可加到DNA的3’末端,每个探针DNA可加上10~20个修饰碱基,北京操作性能好寡核苷酸合成仪对比价。(1)取,插入冰浴中,加入寡核苷酸(3pmol)×μl,5×加尾缓冲液20μl,dUTP4μl(终浓度200μmol/L),修饰的dNTP(生物素-dUTP。
荧光原位杂交外文名Fluorescenceinsituhybridization简写F工程DNA分子杂交材料荧光标记标志物特异寡聚核苷酸片段目的检测该特异微生物种群的存在荧光原位杂交技术发展编辑荧光原位杂交技术问世于20世纪70年代后期。1977年,荧光标记的抗体被应用于识别特异性DNA—RNA杂交II。1980年,。[2]荧光原位杂交技术原理编辑荧光原位杂交技术技术原理是将荧光素直接或间接标记的核酸探针[或生物素、地高辛、dinitrophenyl(I)NP)、aminoacetylAAFfluorine(AAF)等标记的核酸探针与待测样本中的核酸序列按照碱基互补配对的原则进行杂交,经洗涤后直接在荧光显微镜下观察。[2]荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术,原理是利用报告分子(如生物素、地高辛等)标记核酸探针,然后将探针与染色体或DNA纤维切片上的靶DNA杂交,若两者同源互补,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。此时可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待DNA进行定性、定量或相对定位分析。[1]荧光原位杂交技术优点编辑与其他原位杂交技术相比,荧光原位杂交具有很多优点,主要体现在:①F不需要放射性同位素标记,更经济安全。②F的实验周期短。
在DNA转录和复制中复制DNA序列的聚合酶特别重要。脱氧核糖核酸DNA与组zhi蛋白(右图白色部分)的交互作用,这种蛋白质中的碱性氨基酸(左下蓝色),可与DNA上的酸性磷酸基团结合(右下红色)。脱氧核糖核酸结合DNA的蛋白质结构蛋白可与DNA结合,是非专一性DNA-蛋白质交互作用的常见例子。染色体中的结构蛋白与DNA组合成复合物,使DNA组zhi成紧密结实的染色质构造。对真核生物来说,染色质是由脱DNA与一种称为组zhi蛋白的小型碱性蛋白质所组合而成;而原核生物体内的此种结构,则掺杂了多种类型的蛋白质。DNA可在组zhi蛋白的表面上附着并缠绕整整两圈,以形成一种称为核小体的盘状复合物。组zhi蛋白里的碱性残基,与DNA的酸性糖磷酸骨架之间可形成离子键,使两者发生非专一**互作用,也使复合物中的碱基序列相互分离。在碱性氨基酸残基上所发生的化学修饰有甲基化、磷酸化与乙酰化等,这些化学作用可使DNA与组zhi蛋白之间的作用强度发生变化,进而使DNA与转录因子接触的难易度改变,影响转录作用的速率。其他位于染色体内的非专一性DNA结合蛋白,还包括一种能优先与DNA结合,并使其扭曲的高移动性群蛋白。这类蛋白质可以改变核小体的排列方式,产生更复杂的染色质结构。
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