>> 当前位置:首页 - 产品 - 福建**基因荧光定量PCR技术服务 欢迎来电 上海朝瑞生物科技供应

福建**基因荧光定量PCR技术服务 欢迎来电 上海朝瑞生物科技供应

信息介绍 / Information introduction

产生的 ΔRn 值也不同。请注意,荧光信号基线属于非模板依赖性因素,两种预混液的基线是不同的(图 3A)。Ct 值的变化并没有反映出反应系统的整体性能(图 3B)。灵敏度相当的预混液产生的 Ct ***值可能不同,福建**基因荧光定量PCR技术服务。

使用预混液 A 和预混液 B 在等量的人类 gDNA 中进行 RNase P 扩增。(A) Rn 根据循环数进行绘制,并且显示两个反应的基线。(B) 对数 (ΔRn) 根据循环数进行绘制,福建**基因荧光定量PCR技术服务,福建**基因荧光定量PCR技术服务。两种预混液的阈值(绿线)设定为相同水平。对于相同浓度的靶标而言,预混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于预混液 A 的相应值 (CtA),表明预混液 B 的基线较低。使用 Applied Biosystems™ 7500 实时荧光定量 PCR 系统执行所有扩增。

管家基因反应体系: 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物F 0.5μl 3 内参照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待测样品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

  制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。 针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

  反应体系: 序号 反应物 剂量 1 10×PCR缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

  35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72℃延伸5分钟。

  PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

  将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

使用包含 3 种不同浓度的 ROX 染料的预混液对 TGF-β 进行扩增。显示 (A) Ct 值和 (B) 标准差随 ROX 染料浓度的变化。降低 ROX 染料浓度导致 Ct 出现得更早,但是会增大标准差。使用 Applied Biosystems 7500 实时荧光定量 PCR 系统执行所有扩增。

Ct 随 PCR 效率发生变化。蓝色标准曲线的效率为 **(斜率为 –3.3)。绿色标准曲线的效率为 78%(斜率为 –4)。与高效率条件相比(蓝色),在低效率条件下(绿色),扩增量 Y 使 Ct 出现得更早。较低扩增量 (X) 时则情况相反,与高效率条件(蓝色)相比,低效率条件(绿色)使 Ct 出现得更晚。

免责声明: 本页面所展现的信息及其他相关推荐信息,均来源于其对应的用户,本网对此不承担任何保证责任。如涉及作品内容、 版权和其他问题,请及时与本网联系,我们将核实后进行删除,本网站对此声明具有最终解释权。

查看全部介绍
推荐产品  / Recommended Products