胰酶中的酚红有哪些作用？酚红在培养基中被用来作为pH指示剂，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明：酚红可以模拟固醇类***（特别是雌***）的作用。为避免固醇类反应，培养细胞尤其是哺乳类细胞时，建议用不含酚红的培养基。由于酚红干扰检测，在做流式细胞检测时，也会使用不含酚红的培养基或者胰酶。图 2. Phenol red test图片来源网络8、在做细胞凋亡检测时，细胞为什么不能用含有EDTA的胰酶消化？Annexin V（膜联蛋白）是Ca2+依赖的蛋白，EDTA会螯合Ca2+从而影响Annexin V，进而影响结果，因此需选用不含EDTA的胰酶。建议放入培养箱中进行消化，时间可以长一点。随时观察细胞情况，避免消化过度；也可使用细胞刮刀将细胞刮下，后用***吹匀，比消化简单，还可避免使用胰酶带来的伤害。0.25%胰酶消化液（含有EDTA，含酚红）pH值为7.2-7.8。云南重组胰酶常见问题

    ①制备粗酶液称取定量粗胰酶，其胰蛋白酶活性为，胰淀粉酶活性为，胰脂肪酶活性为。将其用pH值为、浓度为0．2mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，然后进行真空过滤，收集滤液并用磷酸缓冲液进行稀释，使胰蛋白酶活性为3-10U/mg，备用。②制备反胶束将AOT置于100℃烘箱中干燥至恒重，放入干燥器中冷却至室温。然后称取，加入10L异辛烷，在搅拌下使其形成均匀的分散液，再加入定量蒸馏水，在200r/min的转速下处理2h，获得浓度为。使用时用异辛烷稀释10倍。③萃取将稀释10倍的AOT-异辛烷反胶束置于萃取器中，按照AOT异辛烷反胶束：粗酶溶液体积比为（2-3):1的比例加入粗酶溶液萃取3-4次，，在300-400r/min的转速下萃取5-10min。如此每次萃取完成后，均进行离心分离，离心机转速为4000-6000r/min，时间10-15min收集、合并离心上层清液，进行反萃取，下层萃余液用于制备胰脂肪酶。④反萃取将荷载胰蛋白酶的AOT-异辛烷反胶束置于萃取器中，在搅拌下加入等体积的反萃取液进行反萃取15-20min萃取液为0．。如此反萃取3次，每次萃取完成后，均进行离心分离，离心机转速为4000-6000r/min,时间为15-20min。分别收集、合并离心上层清液和下层反萃取液，前者再生后可再次萃取胰蛋白酶。 福建国产胰酶生产企业消化液经过过滤除菌,可以直接用于培养细胞的消化,或者一些组织的消化。

乙二胺四乙酸：（EDTA）是一种有机化合物，常温常压下为白色粉末。它是一种能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子结合的螯合剂。动物细胞在粘附的时候，需要有Ca或Mg离子的参与，EDTA与他们结合后，导致动物细胞粘附能力降低，再加上胰蛋白酶的消化作用，使得细胞与瓶壁快速脱离。两者起到了协同消化的作用。难消化的细胞，胰酶中可填加EDTA。EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。如果对贴壁没影响，那么可不离心。

对一般细胞0.25%胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100mlPBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O/2.9gPO4HNa2,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)2称胰酶0.25g3加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中4调PH7.45仍在冰浴中6过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因为EDTA可以络合Ca2，增加消化效力胰酶溶液中的二氧化碳与干冰挥发的二氧化碳可能会极少部分的气体交换。

细胞传代消化时所用胰酶的浓度越高是越好 贴壁细胞的消化：  常用的消化方法主要有酶消化法、离子螯合剂、物理法和冷冻法。其中**常用的是酶消化法。酶消化法：贴壁干细胞酶消化传代时通常采用两种方式：1、加入胰酶等干细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；2、加入胰酶后，镜下观察待干细胞开始脱落时，弃去胰酶，加入培养液并分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对干细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的干细胞先脱落。胰蛋白酶可以用于原代细胞的传代过程中分散组织。福建国产胰酶生产企业

胰酶用0.05%还是0.25%的？需不需要含酚红的？云南重组胰酶常见问题

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37°℃时，胰酶溶液的作用能力**强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如:D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。云南重组胰酶常见问题

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