荧光染料***用于生物学和医学研究中，如流式细胞术、荧光显微镜和免疫组化等，其中荧光淬灭是一个关键的考量因素，因为它直接影响到实验结果的可靠性和准确性。FITC（异硫氰酸荧光素）是一种常用的绿色荧光染料，具有较高的荧光量子产率和激发效率。然而，FITC的一个主要缺点是容易受到环境因素的影响，如pH值、温度、溶剂和离子强度等，从而导致荧光淬灭。此外，FITC的光稳定性相对较低，长时间的光照会导致其荧光强度降低。CY5.5是一种远红外荧光染料，具有较长的激发和发射波长，因此适用于多色荧光标记和深组织成像。CY5.5相对于FITC来说，具有更好的光稳定性，不易受到环境因素的影响。此外，CY5.5的荧光量子产率也较高，使其在荧光标记实验中表现出色。AlexaFluor647是另一种常用的红色荧光染料，具有与CY5.5相似的长波长激发和发射特性。AlexaFluor647的优点是光稳定性较好，可以承受长时间的光照而不易淬灭。此外，它在多种溶剂和pH值范围内都能保持稳定的荧光性能，因此在复杂的生物样本中表现出色。

南京星叶生物科技有限公司Super Fluor系列（效果同Alexa Fluor 系列），质优价廉。 荧光染料，由于灵敏度高，操作方便，逐渐取代了放射性同位素作为检测标记，其应用于荧光探针，细胞染色等。湖南荧光染料高分子

三、细胞实验D-荧光素钾盐体外生物发光试验：D-荧光素钾盐，无菌纯水，完全培养基（自行配制）1、贴壁细胞：将细胞接种于培养板中孵育数小时或过夜，使细胞贴壁。悬浮细胞：可以将细胞接种于培养板后直接进行后续操作，无需孵育。如果倍增时间相对较短，则应考虑倍增时间进行细胞计数。2、将15mg荧光素钾盐溶解于1ml无菌水中，制备成100X荧光素储备液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素钾盐完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。3、用预热好的细胞培养基1∶100稀释100X荧光素储备液（15mg/ml），配制成荧光素工作液（终浓度150μg/ml），即配即用。4、去除培养板中的培养基。5、在成像前，将适量荧光素工作液加入细胞中，然后进行图像分析。注意：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。孵育时间取决于特定的细胞类型。一般来说孵育10分钟就足够了，根据需要进行测试和调整。6、每隔10分钟，**多40分钟，使用VILBERFUSIONFX成像系统检查体外生物发光，确定动力学曲线并找出细胞的峰值成像时间点湖南荧光染料高分子吲哚菁绿的主要作用之一是在医学影像学中作为造影剂。

三、流式细胞仪分析1、取对数生长期的细胞，接种到孔板，过夜培养。2、如果要进行药物刺激，在细胞中加入感兴趣的药物进行干预，继续培养一定时间后，收集细胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重悬细胞，37℃避光孵育15min或更长时间。【注意】：由于细胞种类和实验体系不同，Rhodamine123工作液浓度和孵育时间可以根据预实验或参考文献自行调整。4、用流式细胞仪检测。

四、实验案例1、取对数生长期A549细胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培养基）,37℃培养箱培养4-24h待其贴壁，以便后续实验操作.2、弃掉培养液，PBS洗涤两次.3、用培养基（无血清）稀释Rh123母液制备1～20µMRh123工作液。具体工作浓度取决于细胞类型和细胞浓度。4、将Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分钟.5、去除Rh123工作液并用PBS洗涤三次细胞去除背景色.6、荧光显微镜观察.

SuperFluor活化酯（与Invitrogen的AlexaFluor活化酯完全相同）SuperFlour系列荧光探针，具有更强的荧光强度，更广的pH应用范围（pH4～10）,更好的抗淬灭性。在生物荧光领域已逐渐替代FITC,Cy3,Cy5,Cy5.5,Cy7等荧光染料。1．标记效率低——计算结果显示每摩尔145,000MW的蛋白标记的荧光团少于4mol有以下原因：1）缓冲液中含有痕量伯铵成分，与染料反应降低了标记效率。如果蛋白已经溶于含氨基的缓冲液（如Tris或氨基乙酸），标记前用PBS透析。2）蛋白含量较低(≤1mg/mL)会影响标记效率。3）标记步骤中加入碳酸氢钠的作用是将反应混合物的pH升高至～8，因为在弱碱性环境中标记反应的效率比较高。如果蛋白溶液的缓冲范围在低pH，加入重碳酸盐也无法将pH调节至**适水平。要么加大重碳酸盐的量，要么将缓冲液换成PBS，或用0.1M碳酸氢钠透析等。4）研究显示pH升至9.0～9.4，标记效率和标记速度（只需10min）明显改善。5）不同抗体与荧光团的反应速率不同，染料标记后保留的生物活性程度也不同，因此标准步骤也不是总有比较好的标记结果。为增加标记率，可以对同一样品进行再标记，或减少蛋白的量加大染料的量重新标记。有研究者在室温孵育1小时后再4℃孵育过夜，情况有所改善。Super Fluor 555（效果同Alexa Fluor 555）琥珀酰亚胺酯荧光染料。

Cy3 (Cyanine 3) 是一种发橘黄色荧光的花青素荧光染料。Cy3染料的激发峰和发射峰分别在550 nm和570 nm左右，它的荧光肉眼观察很明亮，并且对pH不敏感，在共聚焦显微镜中可以用532nm（肩峰）或者556nm（顶峰）的激光束激发，在普通荧光显微镜中可以用 TRITC (tetramethylrhodamine) 的滤片观察，所以在绝大部分荧光仪器上都可以使用。Cy3也是Dil等细胞电位追踪剂的母核，所以它是在生物技术中非常有用的荧光染料。在荧光成像时，Cy3的背景荧光一般认为比TAMRA等TRITC系列的染料低。 Cy3可以用来标记蛋白，抗体，多肽等，它常见的使用是标记核酸分子（DNA和RNA）。基于荧光图谱的相似性，Cy3可以被TAMRA，TRITC, BODIPY TMR等染料替代，在需要更明亮，更稳定的替代物时，可以考虑使用AF547或者AF555等。Cy7 DiC18（DiR）是一个亲脂性、近红外荧光花青染料，这个染料常用于标记细胞质膜。湖南荧光染料高分子

D-荧光素钾盐是荧光素酶的水溶性底物，存在于多种发光生物体中。湖南荧光染料高分子

三：贴壁细胞染色1、将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。2、从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，但要使表面保持湿润。3、在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。4、37℃孵育细胞2~20min，不同的细胞比较好培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记效果。5、吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2~3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5~10min，然后吸干培养基。但要使表面保持湿润。四：结果检测样品可在培养基中进行检测，可通过荧光显微镜成像或流式细胞仪分析。湖南荧光染料高分子

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