双光子荧光显微成像主要有以下优点∶a.光损伤小∶双光子荧光显微镜使用可见光或近红外光作为激发光，对细胞和组织的光损伤很小，适合于长时间的研究;b.穿透能力强∶相对于紫外光，可见光或近红外光具有很强的穿透性，可以对生物样品进行深层次的研究;c．高分辨率∶由于双光子吸收截面很小P，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收局限于焦点处的体积约为λ范围内;d.漂白区域很小，焦点以外不发生漂白现象。e．荧光收集率高。与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器，提高了荧光收集率。收集效率提高直接导致图像对比度提高。f.对探测光路的要求低。由于激发光与发射荧光的波长差值加大以及自发的三维滤波效果，多光子显微镜对光路收集系统的要求比单光子共焦显微镜低得多，光学系统相对简单。g.适合多标记复合测量。许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发谱宽阔，这样，可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同一生命现象中的不同信息，便于相互对照、补充。由于双光子激发的特性，它可以获得比传统显微镜更高的分辨率。清醒动物多光子显微镜焦点激发

与传统的单光子宽视野荧光显微镜相比，多光子显微镜（MPM）具有光学切片和深层成像等功能，这两个优势极大地促进了研究者们对于完整大脑深处神经的了解与认识。2019年，JeromeLecoq等人从大脑深处的神经元成像、大量神经元成像、高速神经元成像这三个方面论述了相关的MPM技术[1]。想要将神经元活动与复杂行为联系起来，通常需要对大脑皮质深层的神经元进行成像，这就要求MPM具有深层成像的能力。激发和发射光会被生物组织高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，虽然可以通过增加激光强度来解决散射问题，但这会带来其他问题，例如烧坏样品、离焦和近表面荧光激发。增加MPM成像深度比较好的方法是用更长的波长作为激发光。美国灵长类多光子显微镜中国市场多光子显微镜进出口贸易趋势。

在多光子显微镜（也称为非线性或双光子显微镜）中，以两倍正常激发波长照射样品。更长的波长是有利的，因为它们可以更深地穿透样品进行3D成像，并且因为它们不会损坏样品，从而延长样品寿命。为了实现多光子激发，照明光束在空间上聚焦（使用光学器件），同时使用高能短脉冲激发光束以提高两个（或更多）光子同时到达同一位置（即荧光团分子）的概率。多光子显微技术的例子包括二次谐波产生(SHG)、三次谐波产生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)和受激发射耗尽(STED)显微技术。由于这些技术中的每一种都使用脉冲激光器，因此选择能够比较大限度地减少脉冲色散的光学组件很重要，并且激光反射二向色镜应具有低GDD特性。

以往我们认识的光电效应是单光子光电效应，即一个电子在极短时间内能吸收到一个光子而从金属表面逸出。强激光的出现丰富了人们对于光电效应的认识，用强激光照射金属，由于其光子密度极大，一个电子在短时间吸收多个光子成为可能，从而形成多光子电效应，这已被实验证实。为什么一般讨论的光电效应都是指单光子光电效应呢？这是因为，在使用普通光源的情况下，电子吸收两个以上光子能量的概率是非常非常小的，几乎为零。事实上，爱因斯坦本人就考虑过在强光下发生光电效应的可能性问题。对此，他有如下的论述：光电效应中的一个电子吸收两个光子的几率不会大于下雨天两个雨滴同事打在一个蚂蚁上的几率。因此，多光子光电效应在实验上的研究成为可能，是二十世纪六十年代激光乃至强激光出现以后的事情。有了激光，对于双光子光电效应，在实验上和理论上均取得了许多成果。利用强激光，人们不仅观察到双光子和三光子的光电效应，甚至观察到金靶材吸收几十个等效光子实验现象。实现细胞层面观察，多光子显微镜技术助力医学突破。

作为一个多学科、知识密集型和资金密集型的高科技产业，多光子显微镜涉及医学、生物学、化学、物理学、电子学、工程学等多个学科。其生产工艺相对复杂，进入门槛较高。它是衡量一个国家制造业和高科技发展水平的重要标准之一。在过去的五年里，多光子显微镜的市场是集中的。由于投产成本高，技术难度大，目前涌现的新企业并不多。显微镜作为传统的高科技产业，并没有被其他技术颠覆，而是一直在不断融合发展相关技术，在医疗等精密检测领域发挥更大的作用。显微镜的商业化发展已进入成熟阶段，主要需求来自教学、生命科学研究和精密测试等。全球市场呈现温和增长趋势。而显微镜产品(如多光子显微镜、电子显微镜)正在刺激市场需求，多光子显微镜市场发展潜力巨大。多光子显微镜中，极短的激光脉冲聚焦在样品上的紧密点上，激发荧光团产生图像。在体多光子显微镜研究

OCT可以用于损伤修复监测。Yeh等用OCT、多光子显微镜。清醒动物多光子显微镜焦点激发

单光子激发荧光和双光子激发荧光，是从荧光产生的机理上来区分的。而共焦则是荧光显微镜的一种结构，其目的是为了，通过共焦结构，提高整个荧光显微镜的空间分辨率。所以共焦荧光显微镜可以根据激发光源的不同，实现单光子共焦荧光成像或者双光子共焦荧光成像。往往一个普通的双光子荧光显微镜（没有共焦结构）其空间分辨率也可以达到单光子共焦荧光显微镜的水平。这样就可以简化整个系统，相对来说，就提高了激发光源的利用率，以及荧光的探测效率，这个也是我们提倡双光子荧光成像的原因之一。双光子荧光共焦显微镜由于双光子效应和共焦结构，分辨率则会更高，而我们通常说的共焦显微镜都是指单光子激发荧光的。清醒动物多光子显微镜焦点激发

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