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　　操作步骤

　　1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在 、 孔中分别加标准品 100μl，然后在 、 孔中加标准品稀释液50μl，混匀;然后从 孔、孔中各取 100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μl，混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl弃掉，再各取 50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀;混匀后从第五、第六孔中各取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50μl，混匀后从第九第十孔中各取 50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为 50μl，浓度分别为 150 pg/mL，100 pg/mL ，50 pg/mL，25pg/mL，12.5 pg/mL)。

　　2. 加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μl(样品**终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

　　3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育 30 分钟。

　　4. 配液：将 30(48T的 20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的 20倍)倍稀释后备用。

　　5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。

　　6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

　　7. 温育：操作同 3。

　　8. 洗涤：操作同 5。

　　9. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

　　15 分钟.

　　10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

　　11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。 测定应在加终止

　　液后 15 分钟以内进行。

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